DNA CpG甲基化檢測(cè)

甲基化特異性的PCR（methylation-specific PCR）應(yīng)用

    DNA甲基化在人的正常發(fā)育、X染色體失活、衰老以及許多人類疾病（如發(fā)育畸形、癌癥、心血管疾病、糖尿病和神經(jīng)心理失調(diào)等）過(guò)程中發(fā)揮重要作用，已經(jīng)成為表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容。

    DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式，它不改變DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，卻在細(xì)胞的發(fā)育、基因的表達(dá)、及基因組的穩(wěn)定性中起著重要的作用。CpG島的高甲基化是腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象，而啟動(dòng)子CpG島的高甲基化是除突變和缺失外腫瘤中抑癌基因失活的第三種機(jī)制。

    因此，基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)在臨床診斷（如甲基化檢測(cè)與低劑量CT相結(jié)合）、藥物敏感性檢測(cè)等方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

甲基化特異性PCR法原理（Methylation-specific PCR,MSP） 

    MSP法的原理是基于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyl-transferase, Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應(yīng)，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是*存在的化學(xué)性修飾堿基。CG二核苷酸是zui主要的甲基化位點(diǎn)，它在基因組中呈不均勻分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區(qū)域，在哺乳動(dòng)物中mC約占C總量的2－7％。一般說(shuō)來(lái)，DNA的甲基化會(huì)抑制基因的表達(dá)；針對(duì)特定區(qū)域設(shè)計(jì)引物，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，甲基化的位點(diǎn)可以被當(dāng)作一個(gè)C/T的SNP來(lái)處理；可利用直接測(cè)序法來(lái)判斷是否CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化。具有方便快捷，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，是目前較為常用的甲基化檢測(cè)方法。

 MSP實(shí)驗(yàn)流程：

1.基因組DNA制備，樣本類型有：組織，血液，細(xì)胞，毛發(fā)，唾液等。

2.經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后，未甲基化的胞嘧啶發(fā)生脫氨基變?yōu)槟蜞奏ぃ谆陌奏t不變。

3.DNA修飾后，進(jìn)行純化及回收。 

4.修飾后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

5.電泳或直接測(cè)序檢測(cè)

6.實(shí)驗(yàn)報(bào)告（包括MSP基因組DNA，PCR產(chǎn)物及電泳照片）

樣品要求
1、基因組DNA（≥1µg），純度（OD：1.9-2.0）
2、若提供的材料為新鮮組織、血液、細(xì)胞等生物材料，請(qǐng)?zhí)峁┳銐蛱崛?µg以上基因組DNA的材料量。
3.樣本運(yùn)輸途中，需要加冰袋，或干冰。